[摘 要]：目的：通過體外檢測美寶胃腸膠囊（GIC）對胚胎小白鼠小腸器官型植塊生長的作用以探索GIC修復粘膜損傷的機理。方法：體外培養(yǎng)胚胎小白鼠小腸器官型植塊，并將所有植塊分為兩組：實驗組和對照組。結果：實驗組的小腸器官型植塊能很好地維持存活，并有大量的單個細胞、細胞克隆以及片狀粘膜組織塊長出，生長的時間長，生長狀態(tài)好；而對照組的小腸器官型植塊均很快歸于死亡。二者差異極為顯著。結論：GIC能夠維持胚胎小白鼠小腸器官型植塊的存活，并能促進細胞增殖，某種程度上維持組織的完整性，重新組合成粘膜組織，此結果可能與GIC激活上皮干細胞有關。

[關鍵詞]：GIC；小腸植塊；生長

GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Intestine of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]： Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on intestinal lesion through examining the effect of on the survival and cell growth of organ-type explants of intestinal tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of mouse intestinal tissue in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants could survive in test group. Single cells, cell clones and tissue pieces could grew out of the explants and grew long and well　in test group. Conclusion: could maintain survival of intestinal explants and promote growth of cells from intestinal explants of mouse embryo and this process may be involved in the activation of epithelial stem cells.

[Key words]： GIC; intestinal explant ;　growth

　　大量臨床實踐顯示，GIC可能也是通過激活粘膜上皮干細胞、促進組織細胞生長的機理實現(xiàn)對損傷粘膜修復的，為了證明這一觀點，我們特設計了本實驗。

　　一. 儀器、設備、材料、試劑及實驗動物

　　培養(yǎng)箱（美國Forma）、冰箱（江蘇長嶺）、倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠）、超級恒溫水浴及恒溫電烤箱（重慶四達）、超凈工作臺（北京半導體設備二廠）、顯微成像分析系統(tǒng)（上?？迫穑?、微波爐（廣東Galanz）、微型計算機（北京沐澤）、光學顯微鏡（江蘇光學儀器廠）、各種型號注射器、12孔培養(yǎng)板（丹麥NUNC）、50ml離心管、Eppendorf離心管、微量加樣器（1000μl、200μl、20μl、10μl, 均為法國Gilson）、大小滴頭、玻璃培養(yǎng)皿（φ5cm、φ6cm）、0.22μm微孔濾膜、針頭濾器、顯微外科器械、各種眼科手術器械、有蓋三角燒瓶、有蓋小試管、針頭、GIC（美寶公司生產(chǎn)）、MEM培養(yǎng)基（美國Hyclone）、胎牛血清（杭州三利）、青霉素和鏈霉素（華北制藥）等。

　　實驗動物：昆明種胚胎小白鼠

　　二. 實驗方法：

　　1．取孕16日齡的昆明雌性小白鼠，頸椎脫臼法處死之，先置于75%乙醇中粗洗一遍（2分鐘），再置于75%乙醇中消毒5分鐘；

　　2．用眼科剪以及止血鉗先剪開雌鼠的腹部皮膚，鈍性分離至兩側，充分暴露腹壁肌肉，然后小心剪開腹壁全層，切勿傷及內臟及小鼠胚胎；

　　3．剪開子宮，從宮腔中取出胚胎鼠，置入無菌平皿中；

　　4．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠體表洗滌兩次，每次１分鐘；

　　5．用顯微外科剪刀將胚胎鼠的腹壁剪開，再用顯微外科鑷子夾起鼠近胃端小腸（包括十二指腸和空腸），截?。瞔m左右；

　　6．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　7．用顯微外科剪刀將腸管縱行切開，充分暴露粘膜面；

　　8．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　9．將鼠小腸置于含雙抗（青、鏈）的MEM培養(yǎng)液中沖洗2次，每次1分鐘；

　　10．將鼠小腸剪成極小的器官型植塊，大小約1mm×1mm；

　　11．將植塊置于12孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中央，每孔5塊，間隔約2mm，布局合理，粘膜面向上，輕輕按壓每塊植塊，使其緊貼培養(yǎng)板的表面；

　　12．沿著培養(yǎng)孔的邊緣，每孔中加入約0.5ml的完全MEM培養(yǎng)液，勿使培養(yǎng)液與植塊接觸；

　　13．將培養(yǎng)板置于37，５％培養(yǎng)箱中預孵育１.5小時；

　　14．每孔加完全MEM培養(yǎng)液2ml，輕拿輕放，切勿使植塊飄起，實驗組加GIC；

　　15．實驗組和對照組同步等量換液，每次去掉原液的1/２左右, 再加入相同量的新鮮MEM培養(yǎng)液；

　　16．用倒置顯微鏡觀察植塊生長情況，用顯微成像記錄分析系統(tǒng)記錄所觀察的結果，并用計算機保存圖像。

　　三．實驗結果

　　細胞培養(yǎng)110天內的報告結果：實驗組和對照組的腸組織植塊在培養(yǎng)之初，均能固定在培養(yǎng)孔中央，但隨著培養(yǎng)時間的推移，植塊逐漸脫離培養(yǎng)孔底部平面，游離飄浮于深層培養(yǎng)液中，懸浮的位置仍然靠近培養(yǎng)孔底部，但仍然集中于培養(yǎng)孔中央，少數(shù)位于周邊，植塊的大小和形狀幾乎沒有變化，但在培養(yǎng)的第１０天左右，組織塊就開始變得膨松，然后逐漸裂解為很小的組織塊，并最終成為肉眼不易察覺的組織塊，這時在視野中發(fā)現(xiàn)了單個細胞以及細胞克隆。在培養(yǎng)的第２０天，對照組中的細胞以及細胞克隆逐漸死亡，而實驗組細胞依舊生長良好，單個細胞越來越多，在視野中到處可見，以位于中央部位的最多，細胞圓形，細胞核清晰。細胞呈典型活細胞狀態(tài)。越向外越少，邊緣幾乎沒有，細胞克隆數(shù)也逐漸增多。每個克隆所含有的細胞個數(shù)隨著時間的推移也越來越多。上述結果說明含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基無法提供給組織塊合適而充足的營養(yǎng)，而GIC作為高級細胞培養(yǎng)基能夠提供給細胞合理而充足的營養(yǎng)，保證了組織和細胞的活性。

　　下面為培養(yǎng)過程中，實驗組和對照組的對比圖譜，可以深刻反映兩組的差別。

圖１　培養(yǎng)第24天。圖1A為對照組，圖1B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是大量單個的小腸組織細胞，但其中沒有克隆。
圖2　培養(yǎng)第30天。圖2A為對照組，圖2B為實驗組。對照組中為位于視野中央的大量小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是即將形成克隆的細胞。
圖3　培養(yǎng)第38天。圖3A為對照組，圖3B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊較為完整的小腸粘膜組織。
圖4　培養(yǎng)第42天。圖4A為對照組，圖4B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。

圖5　培養(yǎng)第50天。圖5A為對照組，圖5B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是兩塊小腸粘膜組織。
圖6　培養(yǎng)第85天。圖6A為對照組，圖6B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。
圖7　培養(yǎng)第90天。圖7A為對照組，圖7B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是大量的分散生長的小腸組織細胞。
圖8　培養(yǎng)第97天。圖8A為對照組，圖8B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊由細胞連接起來的片狀結構。

　　GIC可使離體腸粘膜細胞在培養(yǎng)液中重新連接組合成粘膜組織

　　現(xiàn)在一般均采用Trowell法進行體外小腸粘膜組織的器官型培養(yǎng)，此法從人體或動物經(jīng)口腔取材，取材部位為十二指腸遠端和空腸近端，將取出的粘膜（不可能是純粹的粘膜組織，應該還包括粘膜下層、肌層等等，這與我們的做法一致），將粘膜放在金屬網(wǎng)格上，然后粘膜連同網(wǎng)格一起置于多孔培養(yǎng)板中央的孔，其它孔中置入無菌生理鹽水浸泡過的無菌紗布以便保持濕度，蓋好，置入一個密閉容器中，通95%的氧氣和5%的，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。這是目前通用的方法。但此法有明顯的缺點，即方法較為繁瑣，取材量有限，一般每次不能多于10塊活組織，多了容易引起胃腸道出血，取材量受到限制，我們現(xiàn)在采用的方法對其進行了很大的簡化，直接從新處死的胚胎動物體內獲得無菌小腸粘膜組織，取材過程極容易控制量，也容易控制部位，特別方便快捷。

　　由于體外培養(yǎng)目前還沒有適宜的人工合成培養(yǎng)基，現(xiàn)有的報道體外培養(yǎng)的小腸粘膜組織維持存活時間較短，不管是用RPMI-1640培養(yǎng)基（附加葡萄糖、胰島素、谷氨酰胺和胎牛血清），還是用Trowell培養(yǎng)基（附加胎牛血清），細胞均最多存活24~48小時，之后就會出現(xiàn)退化和死亡，一般很難超過48小時，培養(yǎng)基中如果不加血清，時間更短，6~12小時會退化壞死，由于植塊存活時間短，給實驗者提供的檢測時間也很短，使多項目檢測不可能，只能檢測那些用藥之后立即就出現(xiàn)的反應，長期效應無法觀察，使實驗受到了很大限制。而在本實驗中我們使用的含有GIC細胞高級培養(yǎng)基直接打破了現(xiàn)有培養(yǎng)基方面的限制，可以長期培養(yǎng)離體腸粘膜組織，可以長期在光鏡下直接觀察GIC對粘膜生長的影響。

　　本實驗中，GIC對腸粘膜組織的細胞保護作用也得到了明顯體現(xiàn)；對于培養(yǎng)過程中觀察到的片狀粘膜組織，之所以能存在很久時間，并且其內的細胞生長良好，是GIC對細胞外基質的正常代謝產(chǎn)生了影響，細胞外基質是維系細胞相互連接的基礎。

　　為什么胃粘膜能夠在這種環(huán)境中長期生長呢？有兩個原因：一是GIC是營養(yǎng)豐富的細胞培養(yǎng)基及良好的細胞保護劑，另一個是腸道粘膜組織中有粘膜上皮干細胞，GIC啟動了干細胞，使干細胞得以較長時間地生長。

　　對于第一個問題的解釋：

　　GIC有效成分中含有的亞油酸是細胞必需的脂肪酸，是構成細胞生物膜不可缺少的組分，是皮膚、粘膜及深層組織損傷后進行修復的重要材料；有效成分中含有的多種氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸以及多種脂類物質、維生素、微量元素，為腸粘膜細胞的生長提供了豐富的營養(yǎng)；有效成分還具有抗病原微生物作用，對多種細菌、病毒、真菌、原生物都有較強的抑制作用，同時具有抗炎作用；藥物中的有效成分還可以促進細胞的能量代謝，蛋白質及核酸合成和生物膜轉運等功能；緩慢釋放，使細胞持續(xù)得到穩(wěn)定的營養(yǎng)供應。

　　GIC的抗氧化作用表現(xiàn)為抗自由基、穩(wěn)定細胞膜。自由基是廣泛存在于各種化學反應中的活潑基團，倘若其產(chǎn)生過量，從而引發(fā)所謂的自由基鏈式反應，則將導致細胞膜多不飽和脂肪酸的脂質過氧化，所產(chǎn)生的大量脂質過氧化物會損傷細胞膜及細胞內的大分子蛋白質與核酸，對細胞造成損傷。有效成分中維生素E的抗自由基功能是由于其自身結構具有還原性，進而捕捉自由基從而阻斷自由基鏈式反應，起到對機體的保護作用，而其自身則經(jīng)過維生素C和含硫氨基酸的再生而還原或轉變?yōu)轷惢衔?。大量維生素E的存在可使細胞處于流動性高、通透性嚴密的狀態(tài)。這除了可保護膜上大量的多不飽和脂肪酸不被氧化外，還與其可以保護膜蛋白的活性結構有關。

　　對于第二個問題的解釋：

　　腸道粘膜組織中有粘膜上皮干細胞，在合適條件下能夠長期生長，GIC有能力啟動干細胞使之活化。腸道粘膜的上皮組織來源于上皮干細胞（epithelial stem cell）， 用-胸腺嘧啶脫氧核苷（-TdR）標記放射自顯影法觀察瞬間標記后的腸腺細胞發(fā)現(xiàn)，上皮干細胞位于或靠近腸隱窩的部位。為了維持動態(tài)平衡，這些干細胞不斷轉化為短暫繁殖細胞并向中段移動，最后要么分化為具有吸收功能的刷狀緣上皮細胞，要么分化為腸道內分泌細胞。分化后的細胞最后死亡并且從腸絨毛上脫落下來并進入腸腔，任何干細胞都具有生長繁殖的能力，它們是一群分化較低的細胞，這是干細胞與分化細胞明顯的不同，體外培養(yǎng)中最容易增殖的正常細胞是干細胞，干細胞屬于未分化細胞，盡管脫離了體內生長的微環(huán)境，但仍然具有較強的增殖能力。可以斷言由于GIC具有激活表皮干細胞的能力，對粘膜干細胞也應該有相應的激活能力。

　　至于生長的細胞的性質，我們認為一定是粘膜細胞，主要原因有兩個：一是因為上皮干細胞在體外有較強的增殖功能，這已經(jīng)為許多研究結果所證實，腸壁其它細胞均不具備這種能力，本實驗所用的標本中，除粘膜細胞外，數(shù)量最多的應該是腸壁的平滑肌細胞，平滑肌細胞在體外可進行有限的增殖，但不能長期增殖。本實驗完全可以排除平滑肌細胞生長的可能性，因為培養(yǎng)自始至終未曾發(fā)現(xiàn)形態(tài)呈條形或梭形、排列呈束狀的平滑肌細胞生長。再次，目前還沒有發(fā)現(xiàn)平滑肌干細胞，這也是平滑肌在體外不易長期生長的重要原因。其它細胞如粘膜下層疏松結締組織中的動脈、靜脈、淋巴管、神經(jīng)纖維和粘膜下神經(jīng)叢等組織的細胞能如此生長的可能性極小。第二個原因是優(yōu)勢生長的問題，當某種細胞特別容易生長的時候，其它細胞的生長就會受到一定程度的抑制或者完全被抑制，本實驗中腸粘膜細胞在生長中占優(yōu)勢或絕對優(yōu)勢。

參　考　文　獻

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